Disposti in otto sale, sono esposti gli oggetti più preziosi appartenenti alla Basilica secondo i seguenti temi: storia della Basilica, Cristo nel mistero della Natività e della Passione, Maria venerata nella Basilica sotto il titolo di Salus Populi Romani e vari Santi legati in modo particolare alla Basilica.

Sono esposti libri ed oggetti liturgici, reliquiari, ostensori  e calici. Tra le diverse opere di grandi  maestri si possono  ammirare i quadri: Salita al Calvario di Giovanni Bazzi detto il Sodoma, la Madonna con Bambino, S. Antonio da Padova e S. Caterina da Siena di Domenico Beccafumi, tre tavolette con la storia dell'Icona Salus Populi Romani, della fabbrica di Baldassare Croce. All'interno del Museo è esposta la Natività di Arnolfo di Cambio.

Nel sito archeologico, posto sotto la Basilica Papale di Santa Maria Maggiore, è possibile scoprire interessanti reperti di epoca romana: un raro calendario ad affresco, i resti di una domus (I - IV sec. d.C), un esemplare del "Quadrato magico del Sator", interessanti testimonianze della basilica paleocristiana.

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